【37】サンガー法

2020年10月17日 2022年1月20日

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サンガー法（ジ・デオキシ法）を使うと、未知のDNAの塩基配列を明らかにできる。

DNA複製の際、DNAポリメラーゼ（DNA合成酵素）は、鋳型鎖と相補的なヌクレオチド鎖（新生鎖）の3‘末端に、新たなヌクレオチドを”脱水縮合”によって付け加える。

このとき、もし新生鎖の3'末端のヌクレオチドの糖が、DNA本来の"デオキシリボース"ではなく、3'位置の-OHが-Hになった”ジ・デオキシリボース”に入れ替っていると、DNAポリメラーゼは新たなヌクレオチドを付け加えることができず、新生鎖の合成はそこで止まってしまう。

ヌクレオチド鎖の伸長を止めるddNTP（ジ・デオキシリボヌクレオチド三リン酸）を利用すれば、未知のDNAの塩基配列を明らかにすることができる。

「塩基配列を明らかにしたいDNA」に、ヌクレオチド鎖の材料になる４種類のdNTP（dATP,dTTP,dGTP,dCTP）、別々の色で蛍光標識した４種類のddNTP（ddATP,ddTTP,ddGTP,ddCTP）、DNAポリメラーゼとプライマーを加える。
1の“混合液”を、サーマルサイクラー（加熱と冷却を自動でくり返す装置）で複製（増幅）する。複製（増幅）のたびに、ddNTPが取込まれて途中で合成が止まった”様々な長さ”のヌクレオチド鎖ができる。
2の"様々な長さ"のヌクレオチド鎖を、アガロースゲル電気泳動にかけ、ヌクレオチド鎖の”長さ”の順に並べ替える。
3で並べ替えたヌクレオチド鎖（アガロースゲルの上に帯状の”バンド”として見える）の蛍光標識からA,T,G,Cを判別し、５’末端側（最も“長い”距離を泳動した、最も“短い”ヌクレオチド鎖の集まった”バンド”）から、順に塩基配列を読み取る。

DNA（デオキシリボ核酸）も酸なので、水溶液中では水素イオン（陽イオン）と電離して－に帯電しており、電気泳動によって大きさ（長さ）順に並べ替えることができる。

【補足】

PCR（ポリメラーゼ連鎖反応。DNAの特定の配列を増幅する方法。）
ヌクレオチド（リン酸＆糖&塩基の結合した分子。DNAやRNAの材料となる。DNAのヌクレオチドは、リン酸＆デオキシリボース（糖）に、A,T,G,Cの４種類の塩基のどれかが結合している。）
dNTP（デオキシリボヌクレオチド三リン酸。４種類のdNTA（dATP,dTTP,dGTP,dCTP）が連結して、DNAのヌクレオチド鎖ができる。）
ddNTP（ジ・デオキシリボヌクレオチド三リン酸。dNTPでは、糖の3'位置に-OHがあるが、ddNTPは-Hになっている。そのためヌクレオチド鎖の3'末端にddNTPが結合すると、次のdNTP、あるいはddNTPは結合できない。）
サーマルサイクラー（設定した温度や時間にしたがって、自動で加熱と冷却をくり返してくれる装置。PCRやサンガー法で活躍。）
DNAポリメラーゼ（DNA合成酵素。新生鎖の3'末端に、鋳型鎖と相補的なヌクレオチドを付け加えていく。プライマーが無ければヌクレオチド差を合成できす、5'末端にヌクレオチドを付加することもできない"わがまま酵素"。）
アガロース（多数のガラクトースが結合した多糖類。寒天の主成分。アガロースゲル＝純度の高い寒天。）
アガロースゲル電気泳動（アガロースゲルに電流を流すことで、電荷をもつ分子を大きさ順に分離できる。大きい分子ほどゲルに邪魔されて移動しにくく、小さい分子ほど長い距離を移動する。）
バンド（アガロースゲル電気泳動のさいに現れる帯状の模様。同じ大きさの分子が蓄積して”バンド”として見える。）
蛍光色素（特定の波長の光を照射すると、照射した波長とは違う波長の光を発する。）
シークエンシング（サンガー法などにより、DNAの塩基配列を決定すること。）
DNAシークエンサー（アガロースゲル電気泳動～塩基配列の読み取りまでを自動で行ってくれる装置。）

【参考資料】